新疆农业科学 ›› 2023, Vol. 60 ›› Issue (1): 61-68.DOI: 10.6048/j.issn.1001-4330.2023.01.008
才羿1(), 戴冬洋1,2, 谭海1, 王迪3, 杨芬1, 王岭1, 盛云燕1(
)
收稿日期:
2022-05-09
出版日期:
2023-01-20
发布日期:
2023-03-07
通信作者:
盛云燕(1979-),女,黑龙江哈尔滨人,教授,硕士生导师,研究方向为瓜类分子遗传育种,(E-mail)shengyunyan@byau.edu.cn作者简介:
才羿(1997-),女,黑龙江齐齐哈尔人,硕士研究生,研究方向为瓜类分子遗传育种,(E-mail)1299234359@qq.com
基金资助:
CAI Yi1(), DAI Dongyang1,2, TAN Hai1, WANG Di3, YANG Fen1, WANG Ling1, SHENG Yunyan1(
)
Received:
2022-05-09
Published:
2023-01-20
Online:
2023-03-07
Correspondence author:
SHENG Yunyan(1979-), female, Harbin City, Heilongjiang Province, Professor,Master Supervisor, research field: Molecular genetics and breeding of melons,(E-mail)shengyunyan@byau.edu.cnSupported by:
摘要:
【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族,分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体,为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因,分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物,以载体pHSN401为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用Bsa I酶切pHSN401载体,利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌,挑选单克隆进行培养,随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501~605 aa不等,平均分子量约为59 351 Da,等电点为5.04~6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在AMS基因的CDS区设计3个靶位点,分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建甜瓜敲除重组载体AMS-pHSN401并转化农杆菌,获得阳性克隆。
中图分类号:
才羿, 戴冬洋, 谭海, 王迪, 杨芬, 王岭, 盛云燕. 甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建[J]. 新疆农业科学, 2023, 60(1): 61-68.
CAI Yi, DAI Dongyang, TAN Hai, WANG Di, YANG Fen, WANG Ling, SHENG Yunyan. Analysis of Genetic Structure and Construction of Gene Editing Vector of Melon AMS Gene[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2023, 60(1): 61-68.
引物名称 Primer name | 引物序列 (5'-3') Primer sequence(5'-3') |
---|---|
sgAMS-1.F | ATTG CATCATGCAAATAAACCTTG |
sgAMS-1.R | AAAC CAAGGTTTATTTGCATGATG |
sgAMS-2.F | ATTG CCAACTTTTAGTACCCACAA |
sgAMS-2.R | AAAC TTGTGGGTACTAAAAGTTGG |
sgAMS-3.F | ATTG GGAGAGACTAAGACCCCTTG |
sgAMS-3.R | AAAC CAAGGGGTCTTAGTCTCTCC |
测序引物 Sequencing primer | GGATAAACCTTTTCACGCCC |
鉴定引物F Identification Primer F | GGATAAACCTTTTCACGCCC |
鉴定引物R Identification Primer R | ATTGAACGCCGAAGAACA |
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称 Primer name | 引物序列 (5'-3') Primer sequence(5'-3') |
---|---|
sgAMS-1.F | ATTG CATCATGCAAATAAACCTTG |
sgAMS-1.R | AAAC CAAGGTTTATTTGCATGATG |
sgAMS-2.F | ATTG CCAACTTTTAGTACCCACAA |
sgAMS-2.R | AAAC TTGTGGGTACTAAAAGTTGG |
sgAMS-3.F | ATTG GGAGAGACTAAGACCCCTTG |
sgAMS-3.R | AAAC CAAGGGGTCTTAGTCTCTCC |
测序引物 Sequencing primer | GGATAAACCTTTTCACGCCC |
鉴定引物F Identification Primer F | GGATAAACCTTTTCACGCCC |
鉴定引物R Identification Primer R | ATTGAACGCCGAAGAACA |
基因ID Gene ID | 氨基酸数目 Amino acid number/aa | 分子量 Molecular weight /Da | 等电点 Isoelectric point | 亚细胞定位 Subcellular localization | 染色体 Chromosome | 染色体定位 Chromosomal location (bp) |
---|---|---|---|---|---|---|
MELO3C021653.2.1 | 605 | 68637.8 | 5.04 | 细胞核 | Chr 09 | 5019154-5023770 |
MELO3C013851.2.1 | 537 | 58 489.77 | 6.45 | 细胞核 | Chr 06 | 33991207-33993509 |
MELO3C024041.2.1 | 501 | 55 262.12 | 6.16 | 细胞核/胞间层 | Chr 04 | 23240046-23242216 |
MELO3C003412.2.1 | 511 | 55 934.34 | 5.87 | 细胞核/细胞质 | Chr 04 | 995627-998314 |
MELO3C006016.2.1 | 526 | 58 428.33 | 5.72 | 细胞核 | Chr 06 | 590163-592617 |
表2 甜瓜AMS基因理化性质及染色体定位
Table 2 Physicochemical properties and chromosome location of AMS gene in Melon
基因ID Gene ID | 氨基酸数目 Amino acid number/aa | 分子量 Molecular weight /Da | 等电点 Isoelectric point | 亚细胞定位 Subcellular localization | 染色体 Chromosome | 染色体定位 Chromosomal location (bp) |
---|---|---|---|---|---|---|
MELO3C021653.2.1 | 605 | 68637.8 | 5.04 | 细胞核 | Chr 09 | 5019154-5023770 |
MELO3C013851.2.1 | 537 | 58 489.77 | 6.45 | 细胞核 | Chr 06 | 33991207-33993509 |
MELO3C024041.2.1 | 501 | 55 262.12 | 6.16 | 细胞核/胞间层 | Chr 04 | 23240046-23242216 |
MELO3C003412.2.1 | 511 | 55 934.34 | 5.87 | 细胞核/细胞质 | Chr 04 | 995627-998314 |
MELO3C006016.2.1 | 526 | 58 428.33 | 5.72 | 细胞核 | Chr 06 | 590163-592617 |
基因ID Gene ID | α-螺旋 α-helix | 延长链 Extended strand | β-折叠 β-sheet | 无规则卷曲 Random coil | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | |
MELO3C021653.2.1 | 200 | 33.06 | 68 | 11.24 | 22 | 3.64 | 315 | 52.07 |
MELO3C013851.2.1 | 180 | 33.52 | 67 | 12.48 | 13 | 2.42 | 277 | 51.58 |
MELO3C024041.2.1 | 182 | 36.33 | 68 | 13.57 | 14 | 2.79 | 237 | 47.31 |
MELO3C003412.2.1 | 153 | 29.94 | 65 | 12.72 | 10 | 1.96 | 283 | 55.38 |
MELO3C006016.2.1 | 160 | 30.42 | 60 | 11.41 | 13 | 2.47 | 293 | 55.70 |
表3 甜瓜AMS基因各二级结构所占比例
Table 3 Proportions of secondary structure of AMS genes
基因ID Gene ID | α-螺旋 α-helix | 延长链 Extended strand | β-折叠 β-sheet | 无规则卷曲 Random coil | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | 数量(个) Number | 所占比例 Percentage(%) | |
MELO3C021653.2.1 | 200 | 33.06 | 68 | 11.24 | 22 | 3.64 | 315 | 52.07 |
MELO3C013851.2.1 | 180 | 33.52 | 67 | 12.48 | 13 | 2.42 | 277 | 51.58 |
MELO3C024041.2.1 | 182 | 36.33 | 68 | 13.57 | 14 | 2.79 | 237 | 47.31 |
MELO3C003412.2.1 | 153 | 29.94 | 65 | 12.72 | 10 | 1.96 | 283 | 55.38 |
MELO3C006016.2.1 | 160 | 30.42 | 60 | 11.41 | 13 | 2.47 | 293 | 55.70 |
图4 甜瓜AMS基因靶位点位置及敲除载体的构建 注:M:DL4500 DNA Maker;+:阳性对照;1、2、3分别为质粒AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3
Fig.4 The target site location of AMS gene in melon and construction of knockout vector Note: M: DL4500 DNA Maker; +: positive control; 1, 2, and 3 are plasmids AMS-pHSN401-1, AMS-pHSN401-2 and AMS-pHSN401-3 respectively
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